Scopul acestei analize este de a determina in timpul cel mai scurt posibil, agentii etiologici ai infectiilor tractului respirator inferior si a face posibile interventii terapeutice rapide si eficiente asupra pacientilor. Intrucat nu exista un test unic de detectare a tuturor agentilor etiologici, procedura descrisa in cele de mai jos, reprezinta un complex de tehnici, examene si teste prin care se urmareste atingerea, intr-un grad cat mai ridicat , a scopului enuntat.

ACTIUNI PREGATITOARE

Recoltarea sputei si aspiratului traheo bronsic

Examinarea sputei expectorate este materialul principal pentru determinarea cauzelor pneumoniiilor bacteriene. Secretiile tractului respirator inferior, pot fi contaminate cu secretiile tractului respirator superior, in special cu saliva, cand se folosesc tehnici de recoltare invazive. Din aceasta cauza, sputa este printre probele cel mai putin relevante primite pentru examinare prin culturi in laboratoarele de microbiologie, chiar daca ea reprezinta proba obisnuita si pentru a carei examinare se consuma mai mult timp si numeroase materiale. 

Pentru a reduce cat mai mult posibil contaminarea cu saliva si / sau cu secretii nazale, sputa se recolteaza din expectoratia de dimineata, dupa o prealabila gargara cu ser fiziologic.

Sputa se recolteaza in recipiente sterile (cutii Petri, flacoane cu gatul larg ) si se trimite imediat la laborator, in nici un caz sa nu ajunga la laborator in mai mult de 2 ore.

In cazul ca pacientii nu produc sputa sau nu o pot elimina, clinicienii vor folosi metode alternative adecvate (aspiratii sau tampoane traheale sau bronhice).

La copiii mici incapabili sa produca sputa se vor recolta aspirate gastrice pentru detectarea bacililor acido- rezistenti. Daca aceste probe nu pot ajunge imediat la laborator, ele trebuie neutralizate.

Prelucrarea probelor

Portiunile purulente din proba se pun intr-o alta cutie Petri si se spala cu 2 3 ml ser fiziologic.

In cazul sputei neomogene sau vascoase se recurge la fluidificarea ei care se poate realiza astfel:

  • se introduce sputa intr-o cantitate mica de bulion si se agita cateva secunde sau amestecul se aspira si respinge de mai multe ori cu o seringa sterila;
  • sputa se omogenizeaza intr-un balon cu perle, dupa amestecarea ei cu bulion (5-10 ml. sputa + 3-5 ml. bulion);
  • sputa spalata cu ser fiziologic se introduce intr-o eprubeta sterila si se amesteca cu un volum egal dintr-o solutie proaspata 0,5 % de N-acetil- L-cisteina sterilizata prin autoclavare (20 minute la 1210C). Se agita usor. Fluidificarea se produce in cateva minute;
  • fluidificare cu agenti chimici: amestecarea sputei in parti egale cu acetat de amil 1,5 %. Aceasta tehnica degradeaza celulele epiteliale si leucocitele facand frotiul inutilizabil pentru examenul citologic.

MODUL DE LUCRU

Examenul microscopic

Examinarea directa a preparatelor native

Examinarea preparatelor native directe se face in cazul unor paraziti si pentru Pneumocystis.

Elementele fungice se vizualieaza cu microscopul in contrast de faza cu 10% hidroxid de potasiu (KOH).

Pentru aceasta examinare, o picatura din proba prelucrata ca mai sus se depune pe o lama de sticla curata si se acopera cu o lamela. Acest preparat nativ se examineaza la microscop (oc.10, ob. 40 - 45) 

Se noteaza formatiunile constatate.

Examinarea preparatelor ( frotiurilor ) colorate

Din fiecare proba se executa 3 frotiuri care dupa fixare se coloreaza astfel:

un frotiu cu metoda Gram pentru aprecierea florei Gram-pozitive si Gram-negative si stabilirea grupelor de calitate citologica a sputei sau aspiratului traheo- bronsic;

un frotiu cu metoda Ziehl Neelsen pentru bacteriile acido rezistente;

un frotiu cu metoda May - Grnwald Giemsa pentru citologie.

Examinarea frotiurilor consta din aprecierea frecventei germenilor, a caracterelor lor morfologice si tinctoriale si din stabilirea raportului intre elementele celulare . Este important de retinut ca in cazul pneumoniei cu Legionella, sputa poate fi putina si apoasa, cu rare sau absente celule gazda.

Examinarea prin culturi

Se insamanteaza portiuni purulente sau din materialul omogenizat sau fluidificat pe urmatoarele medii:

  • geloza-sange GS. O strie de stafilococ auriu insamantata peste ariile de epuizare a probei permite, prin fenomenul de satelism, izolarea si identificarea in cultura primara a speciilor de Haemophilus;
  • geloza chocolat;
  • agar Mac Conkey si agar cu albastru de bromtimol si lactoza;
  • geloza Sabourand pentru levuri;
  • agar Chapman.

Pentru sputocultura cantitativa este necesara fluidificarea sputei care permite omogenizarea acesteia. 

Din mediile mentionate mai sus minimum indinspensabil este geloza-sange. Aceasta permite izolarea majoritatii bacteriilor implicate in etiologia infectiilor tractusului respirator inferior.

Suprafata mediului turnat in cutii Petri se insamanteaza prin striere cu 0,01ml sputa. Perpendicular pe striile de sputa, se insamanteaza sub forma unei strii o ansa de Staphylococcus aureus. Prin fenomenul de satelism, in vecinatatea striei de S. aureus se vor dezvolta speciile de Haemophilus.

Geloza-sange chocolat favorizeaza dezvoltarea tulpinilor mai pretentioase de Haemophilus si este indispensabil izolarilor cantitative.

Izolarea hemofililor este favorizata in sectoarele cu agar cu sange chocolat pe suprafata caruia se plaseaza discuri cu 10 g, bacitracina, iar a pneumococilor, daca pe un sector cu agar cu sange se depune un disc cu 4 g optochin.

Utilizarea mediilor diferentiale lactozate (MacConkey, AABTL) este facultativa si urmareste izolarea bacteriilor gramnegative reperate microscopic.

Incubarea mediilor insamantate se face 18 24 ore la 37 grade Celsius .

EXAMEN MICROSCOPIC NATIV

EXAMEN MICROSCOPIC COLORAT ZIEHL NEELSEN

EXAMEN MICROSCOPIC COLORAT GRAM